浅析葡萄果实和葡萄酒香气物质的几种GCMS定量方法

前言

葡萄果实和葡萄酒的香气成分种类多，有酯、醇、醛、酮、酸、醚、萜烯、芳香族化合物等；浓度范围宽，有的物质气味阈值低，含量很少却具有明显的特征香气；各物质的化学性质和结构各不相同，存在极性、非极性。同时分析待测样中几十种到几百种不等的香气成分，并且每个样品里面的组分是不同的，浓度大小差别很大，因此香气物质的定量一直是比较复杂麻烦的事情。

目前葡萄果实和葡萄酒的香气物质的定量最常使用的方法是HS-SPME-GC-MS（顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱），测定到的香气物质种类更多，准确性和精密性更好，此外色谱一嗅味分析（GC-O）、气象色谱-火焰离子化检测器法（GC-FID）、气相色谱-离子淌度谱(GC-IMS)、和全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）等方法也有使用。

气相色谱的检测器用于检测经过色谱柱分离后的组分，要根据待测样品的成分和性质选择合适的检测器。目前常用的检测器主要有FID检测器、ECD检测器、TCD检测器、NPD检测器和FPD检测器，其功能用途可参考浅析气相色谱常用的五种检测器。FID检测器的稳定性好、动态线性范围很宽；而质谱总离子色谱图(TIC)稳定性差，线性范围窄。所以香气香味样品一般最好用气相色谱FID来定量，而不用质谱总离子色谱图(TIC)来定量。对非常痕量的成分，可选用选择离子(SIM)来定量，或者FPD、NPD等特殊检测器来定量，因为FID可能不一定能够测定出来。即对于香精香料香气香味样品先需要GCMS检索确定组分（定性）后，然后最好FID来定量。不得已，在没有条件的情况下，可以考虑（只能）用质谱总离子色谱图(TIC)来定量。——浅谈香精香料香气香味样品的定量问题1

具体到各香气成分的定量计算方法目前主要有归一化法、外标法和内标法等。目前很多初学者对于这几种方法的使用不太清晰，存在错用、乱用等问题，本文总结了网上诸多文献资料，详细阐述了香气成分定量方法的使用方法，希望能对初学者有所帮助。

归一化法

定义：把所有出峰组分的含量之和按100％计，计算各个组分峰面积占总峰面积的百分率，称为归一化法。

使用方法：各组分的质量百分含量c_i

归一化法定量的主要问题是质量校正因子（f_i）的测定较为麻烦，虽然一些校正因子可以从文献中查到，但要得到准确的校正因子，还是需要用每一组分的标准物质直接测定。气相色谱的一些主要检测器如FID和TCD对某些组分，如同系物的校正因子相近或有一定的规律，从文献中可以查到或进行计算。

当校正因子相近时，可直接用峰面积归一化进行定量分析，即校正因子均视为1，各组分的峰面积比等于质量百分含量比。

例如下表中给出了C8芳烃异构体的分析结果，四个组分的FID检测器的相对质量校正因子在0.96-1.00（以对二甲苯为参照）之间，结果给出了用校正因子进行归一化法的定量结果和直接用峰面积进行归一化的定量结果。比较两个结果，误差很小，在这种情况下直接用峰面积归一是十分方便的，也是误差范围所允许的。此外针对杂质的粗略检测，也是无需考虑校正因子，直接使用峰面积归一化法进行定量。

应用范围：只有当样品中所有组分均能流出色谱柱，在检测器上都能产生信号的样品，才可用归一化法定量。归一化法只能进行各组分的相对定量，得出百分含量，可用于粗略考察待测样中的杂质含量，一般不宜用于微量杂质的检测和各成分的准确定量。

特点：

1. 要求所有组分都流出并且被检测到；

2. 无需标准曲线；进样量不严格要求；

3. 当所有组分的校正因子（响应因子）相同或十分接近时，峰面积比即等于百分含量比

现在我们测定葡萄果实与葡萄酒香气物质含量基本上不用归一化法了，首先是香气成分复杂，差异巨大，各成分校正因子的值差异很大，若要测定校正因子，工作量十分巨大，如果直接使用峰面积归一化法，默认所有成分的校正因子都为1，则含量肯定不够准确。况且归一化法只能计算相对百分含量，无法进行绝对定量，目前这种方法只适用于香原料（成分比较单一）或杂质的简单检测。浅谈香精香料香气香味样品的定量问题1

外标法

定义：外标法（external standard method）是色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量，此法可分为标准曲线法（工作曲线法）和外标一点法，即一个是多点校正，另一个是单点校正。

使用方法：标准曲线法是用对照物质（各组分的标准品）配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算。标准曲线法也可以用外标二点法代替（即每种物质只进两个不同浓度的对照品溶液，计算斜率、截距）。标准曲线的截距通常应该为零（理想状态下，实际上是接近0），若不为零说明存在系统误差（可以消除）。

外标一点法（单点校正法）是用一种浓度的对照品i溶液对比测定样品溶液中i组分的含量，将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：

W_i＝A_i*(W_s／A_s)

式中W_i与A_i分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的质量浓度及相应的峰面积。W_s及A_s分别代表在对照品溶液进样体积中含标准品i组分的质量浓度及相应峰面积。其实是默认标准曲线截距为0，决定系数R2为1，以原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在较大系统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。所以为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。

标准曲线拟合公式：c_i=f_iA_i+b ，f_i ——i组分工作曲线斜率，其实这里的斜率就相当于绝对质量校正因子了

应用范围：应用十分广泛，只要存在标准品的物质，基本都可以使用外标法来定量。但是对于香精香料这种存在几百上千种香气成分的待测物质，外标法的工作量十分巨大，这需要做数千种化合物的校正曲线，而且由于仪器状态不断变化，还要不断更新，加上有的成分还没有标准品，所以一般是不会采用外标法来对香精样品来定量的，特殊组分除外。

特点：

实验室最常用的定量方法，定量结果较为准确；
不需要所有峰都流出或被检测到，只对目标组分校正；
需要配置一系列标准品溶液，且进样量必须准确；
仪器必须有良好的稳定性，需要定期对标准曲线校正；
每个样品分析的色谱条件（检测器响应性能、柱温、流动相组成及流速，进样量，柱效等）很难完全相同，因此操作不当或者仪器故障容易出现较大误差；
对样品前处理过程中被测组分的变化无法进行补偿

现在外标法在葡萄果实和葡萄酒香气成分的定量中应用还算广泛，因为研究者往往只关注那几十种关键的呈香物质，所以只需做个几十个的外标工作曲线，工作量还算可以接受。

内标法

定义：内标法是一种间接、相对的校准方法，在待测的样品中准确加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的量及其在色谱图相应的峰面积比计算出被测定组分的含量。

使用方法：在用内标法做色谱定量分析前，需测定待测物各成分和内标物的相对质量校正因子，先配制相同浓度的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积比，计算校正因子。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与测定校正因子时所用的条件一致，因此，测定校正因子时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。一般来说对于FID定量，其线性浓度范围宽，因此单点校正即可。但是在多数研究中笔者发现，很多研究者使用了多点校正，即测定了一系列内标标准曲线来确定相对校正因子，这样会极大增加工作量，但准确性也相对更高。

试样配制：准确称取一定量的试样W_i，加入一定量内标物W_IS

W_i=f_iA_i，W_IS=f_ISA_IS

W_i=f_iA_i/f_ISA_IS*W_IS=f_i'A_i/A_IS*W_IS

f_i'为待测组分i对内标物IS的相对质量校正因子，f_i和f_IS分别为试样标准品和内标物的绝对质量校正因子

应用范围：内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术，应用范围广泛，精度高。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。

理想地说，内标物应当是一个能得到标准品的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。如果有条件，运用同位素标记化合物做内标物，其化学性质、色谱特性等都与目标化合物一致，因此校正精度更高（用于痕量杂质的检测）。

特点：

1. 多用在国际标准和规定比较严格的方法中

2. 临床上检测内源性化合物应用较多

3. 进样量不严格要求，内标的加入消除了由于进样量、仪器不稳定等因素带来的系统误差

4. 样品前处理（如浓缩、萃取，衍生化等）前加入内标物，可部分补偿被测组分样品前处理过程的损失

5. 样品中必须加入等量的同一内标物

6. 操作相对繁琐

7、内标物的选择较困难

内标物的选择条件:

1. 样品中不存在

2. 化学性质与样品相似

3. 与样品有相同的线性浓度范围

4. 不会与样品发生反应

5. 色谱性质稳定，可迅速容易得到

内标法在葡萄果实与葡萄酒香气物质的定量中是应用最广泛的，最常见的内标物为4-甲基-2-戊醇和2-辛醇，是研究者最常使用的方法。但笔者发现，不少研究者常常不进行相对校正因子的测定，直接默认为1来进行各成分的定量，这样定量显然不够准确，在这我推荐好好看看朱老师的解答浅谈香精香料香气香味样品的定量问题2----内标法和【第三届原创参赛】在安捷伦5975GCMS上进行内标法定量简介

关于校正因子与标准曲线

由于同一检测器对不同物质的响应值（即为某一物质在检测器所产生的信号强度、包括电信号，峰高，峰面积等）不同，所以当相同浓度的不同物质通过检测器时，产生的峰面积不一定相等，这种情况下使用峰面积进行反映待测组分的含量就会出现误差。所以为了消除这个误差，需要加入一个校正值，使得相同浓度的不同物质通过检测器时的峰面积经过校正后可以定量的代表物质的含量，这个校正值就是我们常提到的校正因子。

校正因子分为绝对校正因子和相对校正因子。绝对校正因子：物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值。相对校正因子：某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比。归一化法和外标法使用的就是绝对校正因子，内标法则是使用的相对校正因子。标准曲线（多点校正法）的目的就是在系统误差存在的情况下，精确测量绝对校正因子和相对校正因子来进行定量，而单点校正和双点校正就是在系统误差很小可忽略不计、检测器对物质的线性浓度范围很好的情况下，仅通过一个或两个不同浓度的待测物质标准品的测样来计算校正因子。一文看透校正因子的奥秘、【气相色谱特辑四】定量分析 - 气相色谱 - 实验与分析